HPLC เทียบกับ LC-MS ในการยืนยันชนิดเปปไทด์

เริ่มจากคำถามทางการวิเคราะห์

ก่อนเปรียบเทียบเครื่องมือ ควรกำหนดก่อนว่าต้องการตอบคำถามอะไร วิธีวิเคราะห์แต่ละชนิดถูกออกแบบมาเพื่อวัดคุณสมบัติบางด้าน วิธีที่แยกองค์ประกอบได้ดีไม่ได้หมายความว่าจะเป็นการทดสอบชนิดสารโดยอัตโนมัติ และผลด้านมวลไม่ได้อธิบายความบริสุทธิ์ทั้งหมด

• ความบริสุทธิ์: สัญญาณทางโครมาโทกราฟีที่ตรวจพบเป็นพีคหลักมากเพียงใด
• ชนิดสาร: วัสดุที่ตรวจพบสอดคล้องกับโมเลกุลที่ตั้งใจหรือไม่
• ปริมาณ: มีวัสดุเป้าหมายอยู่มากเพียงใด
• สถานะทางจุลชีววิทยาหรือเอนโดทอกซิน: ผ่านเกณฑ์เฉพาะอีกชุดหนึ่งหรือไม่

HPLC ให้ข้อมูลอะไร

HPLC แยกองค์ประกอบในตัวอย่างตามการมีปฏิสัมพันธ์กับเฟสอยู่กับที่ และระบบตัวทำละลายที่เคลื่อนที่ ตัวตรวจวัดบันทึกองค์ประกอบที่แยกออกมาตามเวลาและสร้างเป็นโครมาโทแกรม

เมื่อพื้นที่พีคหลักถูกเปรียบเทียบกับพีคอื่น ผลสามารถสนับสนุนค่าความบริสุทธิ์เชิงสัมพัทธ์ทางโครมาโทกราฟีได้ แต่ผลขึ้นอยู่กับวิธี เช่น คอลัมน์ เฟสเคลื่อนที่ ตัวตรวจวัด การคำนวณพื้นที่พีค และการเตรียมตัวอย่าง

• ช่วยแยกองค์ประกอบที่ตรวจพบ
• ช่วยประเมินความบริสุทธิ์เชิงสัมพัทธ์
• ช่วยดูพีคอื่นและเวลาเก็บกัก
• ไม่ใช่หลักฐานยืนยันชนิดโมเลกุลที่แน่นอนเพียงลำพัง

ทั้งสองวิธีอาจใช้วัดปริมาณได้เมื่อสอบเทียบและตรวจสอบความใช้ได้เพื่อจุดประสงค์นั้น เปอร์เซ็นต์ความบริสุทธิ์เพียงอย่างเดียวใช้แทนไม่ได้ [2]

แมสสเปกโทรเมทรีให้ข้อมูลอะไร

แมสสเปกโทรเมทรีวัดไอออนตามอัตราส่วนมวลต่อประจุ เปปไทด์อาจปรากฏในหลายสถานะประจุ จึงต้องตีความสเปกตรัมมากกว่าการอ่านตัวเลขเดียว [1]

หากรูปแบบมวลที่วัดได้สอดคล้องกับมวลทฤษฎีของลำดับเป้าหมายและการดัดแปลงที่ระบุ ผลดังกล่าวจะช่วยสนับสนุนการยืนยันชนิดโมเลกุล แต่ยังเป็นการวัดคนละด้านกับความบริสุทธิ์ทางโครมาโทกราฟี

ต้องตีความมวลที่ตรงภายใต้ความจำเพาะที่แสดงไว้ของวิธี ไม่ถือว่าเป็นการพิสูจน์ลำดับอย่างจำเพาะ [2]

LC-MS รวมการแยกและการตรวจมวลอย่างไร

LC-MS เชื่อมโครมาโทกราฟีของเหลวกับแมสสเปกโทรเมทรี โดยแยกองค์ประกอบก่อนเข้าสู่แมสสเปกโตรมิเตอร์ ทำให้ข้อมูลเวลาเก็บกักและข้อมูลมวลสามารถเชื่อมกันได้ในกระบวนการทำงานเดียว

การรวมกันนี้ทำให้บันทึกมีรายละเอียดมากขึ้น แต่ไม่ได้ยืนยันปริมาณเปปไทด์ ความปราศจากเชื้อ เอนโดทอกซิน หรือฤทธิ์ทางชีวภาพโดยอัตโนมัติ

ความบริสุทธิ์ไม่ใช่ชนิดสาร

ค่า HPLC ที่สูงและผลมวลที่สอดคล้องกับสารเป้าหมายช่วยเสริมข้อมูลคนละส่วน ไม่ควรนำผลหนึ่งไปแทนความหมายของอีกผลหนึ่ง

• HPLC: การแยกและความบริสุทธิ์เชิงสัมพัทธ์
• LC-MS / แมสสเปกโทรเมทรี: ข้อมูลมวลและการสนับสนุนชนิดสาร
• ปริมาณสาร / การวิเคราะห์ปริมาณ: ปริมาณวัสดุเป้าหมาย
• การตรวจสอบย้อนกลับประจำล็อต: การเชื่อมตัวอย่างกับล็อตจริง

เหตุใดจึงใช้วิธีที่มีหลักการวัดต่างกัน?

วิธีที่ใช้หลักการวัดต่างกันเรียกว่าวิธีแบบออร์โธกอนัล หากเลือกวิธีอย่างเหมาะสมและได้ผลที่สอดคล้องกัน ข้อมูลร่วมกันอาจมีน้ำหนักมากกว่าการวัดชนิดเดียวซ้ำ ๆ [2]

คุณค่าเกิดจากความแตกต่างของวิธี ไม่ใช่การรวมผลทั้งหมดให้เป็นคะแนนเดียว

การอ่านผล HPLC และ LC-MS ในบันทึกประจำล็อต

บันทึกเฉพาะล็อตควรทำให้เห็นชัดว่าผลใดมาจากการทดสอบใด HPLC ควรถูกอ่านเป็นหลักฐานทางโครมาโทกราฟี ส่วน LC-MS หรือแมสสเปกโทรเมทรีควรถูกอ่านเป็นหลักฐานด้านมวลและการยืนยันชนิดสาร

• ตรวจว่าหมายเลขล็อตหรือรหัสตัวอย่างตรงกัน
• ระบุวิธีวิเคราะห์ที่เชื่อมกับแต่ละผล
• ตรวจวันที่ทดสอบหรือวันที่รายงาน
• ดูโครมาโทแกรมหรือสเปกตรัมต้นฉบับเมื่อมีการเผยแพร่
• แยกช่องข้อมูลด้านชนิดสาร ความบริสุทธิ์ และปริมาณ

ข้อผิดพลาดในการตีความที่พบบ่อย

• ใช้เปอร์เซ็นต์ HPLC สูงเป็นหลักฐานยืนยันชนิดโมเลกุล
• ใช้ผลมวลที่ตรงกันเป็นหลักฐานยืนยันความบริสุทธิ์ทั้งหมด
• เปรียบเทียบผลจากวิธีต่างกันราวกับเป็นวิธีเดียวกัน
• ไม่ตรวจหมายเลขล็อตและพึ่งรายงานทั่วไปในอดีต
• ใช้ข้อมูลคุณภาพทางการวิเคราะห์เป็นหลักฐานด้านประสิทธิผลทางคลินิก

บันทึกที่กระชับแต่เชื่อมโยงข้อมูลได้ชัดเจนมีประโยชน์มากกว่าชุดรายงานจำนวนมากที่ตรวจสอบย้อนกลับไม่ได้